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Molecular determinants for the subcellular distribution of the synapto-nuclear protein messenger Jacob

Autor :Jale Sahin
Herkunft :OvGU Magdeburg, Fakultät für Naturwissenschaften
Datum :15.02.2010
 
Dokumente :
Dataobject from HALCoRe_document_00007959
 
Typ :Dissertation
Format :Text
Kurzfassung :Jacob ist ein neues Mitglied der PSD-Proteine und wurde als Interaktionspartner des neuronalen Kalzium-Sensorproteins Caldendrin im Rattenhirn identifiziert. Ähnlich wie Caldendrin ist Jacob in der PSD und im somato-dendritischen Kompartiment von Neuronen lokalisiert, befindet sich darüber hinaus aber zusätzlich in deren Zellkernen. Bereits in früheren Untersuchungen wurde durch unser Labor gezeigt, dass nach Stimulation des N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) Rezeptors eine Translokation von Jacob in den Zellkern stattfindet, was eine sehr schnelle Reduzierung synaptischer Kontakte zur Folge hat und zu einer drastischen, morphologischen Veränderung dendritischer Fortsätze führt. Die Translokation von Jacob aus den distalen Bereichen der Dendriten in den Zellkern verläuft über den klassischen „Importin-Pathway“ und wird durch eine Bindung von Importin- an das Kernlokalisierungssignal (nuclear localization signal, NLS) von Jacob vermittelt. Die NLS-Sequenz von Jacob befindet sich in der zentralen -helikalen Region des Proteins, welche außerdem eine unvollständige IQ-Domäne, den Bereich für die Caldendrin-Bindung, enthält. In Abhängigkeit von der jeweiligen Kalzium- (Ca2+) Konzentrationen kontrolliert Caldendrin die Lokalisation Jacobs außerhalb des Zellkerns, indem es kompetitiv die Bindung an Importin- verhindert. Bei hohen Ca2+-Konzentrationen, welche nur durch Aktivierung synaptischer NMDA-Rezeptoren erreicht werden können, bindet Caldendrin an die IQ-Domäne von Jacob, maskiert die NLS-Bindungsstelle und verhindert somit durch Blockierung der Importin- -Bindung den Kerntransport von Jacob. Zusätzlich stellt die N-Myrestoylierung von Jacob, welche das Protein an Membranstrukturen der Zelle bindet, einen weiteren Weg zur Regulation der Lokalisation von Jacob außerhalb des Zellkerns dar. Die vorgelegte Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung weiterer Determinanten, die, die subzelluläre Verteilung von Jacob und seinen Transport in den Zellkern beeinflussen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde erstmalig die Interaktion zwischen -Internexin, einem Protein des Neurofilaments und Jacob nachgewiesen und charakterisiert. In diesem Zusammenhang wurde vorgeschlagen, dass -Internexin eine Bindungsstelle für Jacob im somato-dendritischen Kompartiment von Neuronen darstellt. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde die Jacob- -Internexin-Interaktion detailierter charakterisiert, mit dem Resultat, dass α-Internexin offensichtlich über zwei Bindungsdomänen für Jacob verfügt. Überexpression von JacobΔNLS in jungen Primärneuronen des Hippokampus führt in den Dendriten zu einer Bildung großer, PSD-artiger Protrusionen. In diese können verschiedene Jacob-Interaktionspartner und PSD-Komponenten rekrutiert werden. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Frage, durch welche Mechanismen Jacob die Entstehung von Protrusionen induziert sowie andere Proteine in diesen Bereich rekrutiert. -Internexin selbst konnte nicht in den Protrusionen nachgewiesen werden. Anstatt dessen scheint es die Bildung dieser Bereiche negativ zu beeinflussen. Da in unserem Labor auch gezeigt werden konnte, dass Jacob Homodimere bildet, wurde in diesem Zusammenhang zusätzlich untersucht, ob Jacob-Dimere (möglicherweise auch Oligomere) die Bildung der Protrusionen initiieren können. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde die Jacob- Dimer-Bildung detailierter analysiert und die kleinste erforderliche Dimerisierungssequenz identifiziert. Wie eingangs beschrieben, ist Jacob N-myristoyliert und muss vom N-Terminus gespalten werden, bevor dessen Translokation durch Aktivierung des NMDA-Rezeptors stattfinden kann. Abschließend wurden daher Mechanismen untersucht, in deren Folge Jacob von den jeweiligen Bindungsstellen freigesetzt wird. Die Rolle von Calpain, einer Cystein-Protease, bei der Spaltung des N-Terminus sowie anschließendem Kerntransport von Jacob stand dabei im Mittelpunkt weiterer Untersuchungen. Dabei konnte gezeigt werden, dass der Kerntransport von endogenem Jacob nach Stimulation durch NMDA in Gegenwart von Calpain-Inhibitoren blockiert wurde. Darüberhinaus zeigen Ergebnisse von Experimenten in vivo, dass die Translokation von „greenfluorescent- protein“ (GFP)-markiertem Jacob-wt in distalen Dendriten transfizierter Neurone nach NMDA-Applikation vollständig durch die Gegenwart eines Calpain- Inhibitors verhindert wird. Letztendlich konnte durch Spaltungs-Assays mit Calpain in vitro, erstmalig Jacob als dessen Substrat innerhalb von Neuronen beschrieben werden.
Schlagwörter :Jacob, synaptic plasticity, alpha-Internexin, Calpain, N-terminal truncation, NMDA receptor activation, dimerization
Rechte :Dieser Text ist urheberrechtlich geschützt
Größe :113 S.
 
Erstellt am :04.03.2010 - 07:53:22
Letzte Änderung :22.04.2010 - 08:17:57
MyCoRe ID :HALCoRe_document_00007959
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