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Aufreinigung von vollständigen Influenzaviren für die Impfstoffherstellung

Autor :Bernd Kalbfuß-Zimmermann
Herkunft :OvGU Magdeburg, Fakultät für Verfahrens- und Systemtechnik
Datum :11.08.2009
 
Dokumente :
Dataobject from HALCoRe_document_00007877
 
Typ :Dissertation
Format :Text
Kurzfassung :Die durch Influenzaviren verursachte Grippe ist ein Atemwegsinfekt, an dem jährlich bis zu 10% der Weltbevölkerung erkranken. Zusätzlich besteht das unkalkulierbare Risiko einer Pandemie, welches erst kürzlich durch die Übertragung von Vogelgrippeviren auf den Menschen in das Bewusstsein der Öffentlichkeit gerückt ist. Vorbeugende Impfung ist gegenwärtig die einzige wirkungsvolle Maßnahme zum Schutz gegen Influenzaviren. Die Herstellung von sicheren Influenzaimpfstoffen in ausreichenden Mengen ist daher von großer Bedeutung für die öffentliche Gesundheitsversorgung. Herkömmlich werden Influenzaviren in befruchteten Hühnereiern kultiviert. Seit etwa 15 Jahren gewinnt jedoch die Vermehrung in tierischer Zellkultur immer mehr an Bedeutung. Die Aufreinung von Influenzaviren aus tierischer Zellkultur für die Herstellung von inaktivierten Ganzvirion-Impfstoffen ist das Thema dieser Arbeit. Die humanen Influenzaviren A/PR/8/34 (H1N1), A/Wis/67/2005 (H3N2) und B/Mal/2506/2005 wurden in MDCK-Zellen als Wirt gezogen. Ihre Kultivierung in Rollerflaschen wurde hinsichtlich der Freisetzung der Virionen sowie von Verunreinigungen charakterisiert. Die Bestimmung eines geeigneten Erntezeitpunkts auf der Basis von statistischen Quantilen der HA-Aktivität, welche sich durch Interpretation des Freisetzungsprofils als Summenverteilung bestimmen lassen, wird beschrieben. Die Trübung des Kulturüberstandes, welche die Ablösung der Zellen und deren Lyse widerspiegelt, wird als ein Marker zur Überwachung des Infektionsfortschrittes vorgeschlagen. In Abhängigkeit vom Virusstamm und Kulturmedium ergaben sich in Rollerflaschen mittlere HA-Aktivitäten zwischen 130 und 450 HAU (0.1 ml)‑1. Ausgehend von theoretischen Betrachtungen wurde ein Hemagglutinin-Antigenhalt zwischen 0.42 und 1.5 µg ml‑1 auf der Basis der gemessenen HA-Aktivitäten geschätzt. Die mittleren Konzentrationen an Wirtszell-DNA waren mit Werten zwischen 5.9 und 8.9 µg ml‑1 vergleichsweise einheitlich. Die Gesamtproteinkonzentration (34 µg ml‑1 mit GMEM-basiertem bzw. 62 µg ml‑1 mit Ex-Cell MDCK-Medium) hingegen schien überwiegend vom Kulturmedium abzuhängen bzw. der Durchführung eines Mediumwechsels vor der Infektion, welche bei GMEM-basiertem Medium notwendig war. Ausgehend von den Spezifikationen des europäischen Arzneimittelbuches (EA) und den mittleren Resultaten aus der Viruskultur wurde die Notwendigkeit einer 20 000-fachen Abreicherung des virusspezifischen DNA-Gehaltes sowie einer 10-fachen Abreicherung des Proteingehaltes berechnet. Es wurden zwei Aufarbeitungsschemata hinsichtlich ihrer Eignung und Einhaltung der zuvor beschriebenen Anforderungen untersucht. Im ersten Schema wurde der virushaltige Kulturüberstand mittels zweifacher Normalfluss-Filtration (NFF) geklärt und die Viren im Anschluss durch Zugabe von β‑Propiolakton chemisch inaktiviert. Die inaktivierten Viren wurden mittels Tangentialfluss-Ultrafiltration (TFUF) aufkonzentriert und die Abtrennung des verbleibenden Wirtszellproteins durch Gelfiltration (GF) erreicht. Die noch enthaltene Wirtszell-DNA wurde durch Anionenaustausch-Chromatographie (AIEC) im Durchflussverfahren weiter abgereichert. Die Adsorption der Virionen an die stationäre Phase wurde durch Konditionierung der virushaltigen Eluatfraktion auf hohe Salzkonzentrationen während der GF erreicht. Die Gesamtvirusausbeute nach der AIEC betrug 53% basierend auf der HA-Aktivität. Der virusspezifische Gehalt an Wirtszell-DNA wurde etwa 270-fach, der Gehalt an Gesamtprotein etwa 15-fach reduziert. Die Abreicherung der Wirtszell-DNA war folglich unzureichend bezüglich der Forderungen des EA. Die Optimierung der Betriebsbedingungen während der GF wurde retrospektiv in einer Modellierungsstudie adressiert. Präparationen unter den abgeleiteten Bedingungen stehen jedoch noch aus. Im zweiten Schema wurde die Zentrifugation als Alternative zur NFF untersucht. Ihre Leistungsfähigkeit wurde auf Basis der Sigma-Theorie charakterisiert. Zusätzlich wurde ein weiterer DNA-Abreicherungsschritt, realisiert durch die selektive Fällung von DNA mittels Polyethylenimin, in den Prozess aufgenommen. Die Selektivität des Verfahrens konnte durch Ausführung und Auswertung eines faktoriellen statistischen Versuchsplans („Factorial Design“) verbessert werden. Der pH-Wert und die Ionenstärke wurden hierbei als kritische Faktoren identifiziert. Die gefällte DNA wurde durch eine Kombination aus Zentrifugation und Membranmikrofiltration abgetrennt. Nach Inaktivierung wurde der Virus wieder mittels TFUF aufkonzentriert; gefolgt von einem Diafiltrationsschritt bei konstantem Volumen zwecks Abreicherung von Wirtszell-Proteinen und zur Vorbereitung auf die nachfolgende chromatographische Feinreinigung („Polishing“). Abschließend wurde der Versuch der adsorptiven Feinreinigung mittels Monolithen und gepackten Betten unternommen. Geeignete Liganden waren zuvor in Vorversuchen mit Membranadsorbern ermittelt worden. Die Machbarkeit einer direkten Anreicherung („Capture“) von Influenzaviren aus Kulturüberstand mittels Anionenaustausch-Membranchromatographie wurde in einem Nebenprojekt belegt. Obwohl die Charakterisierung des zweiten Schemas noch nicht abgeschlossen ist, kann bereits von einer zusätzlichen Abreicherung der Wirtszell-DNA um den Faktor 6.5 durch die selektive Fällung ausgegangen werden. Die Gesamtabreicherung der Wirtszell-DNA nach Diafiltration erreichte den Faktor 500, während die Abreicherung nach TFUF im ersten Prozess lediglich den Faktor 3 beziehungsweise nach GF den Faktor 8 erreichte. Die Gesamtausbeute an Virus war hingegen, auf Grund der hohen Verluste während der Diafiltration, mit weniger als 50% vergleichsweise gering. Die mittlere Gesamtausbeute im ersten Prozess betrug 77% nach TFUF beziehungsweise 65% nach GF. Erste Ergebnisse bezüglich der adsorptiven AIEC mit Monolithen und gepackten Betten lassen auf die Erreichbarkeit einer endgültigen DNA-Belastung in der Größenordnung von 10 ng pro Dosis schließen, welche vom EA gefordert wird. Trotz dieser viel versprechenden Ergebnisse bleibt die Robustheit der adsorptiven AIEC hinsichtlich weiterer Virusstämme zu überprüfen. Weiterhin ist es wichtig, die Virusausbeuten nach der Diafiltration zu verbessern. Darüber hinaus verbleibt der mögliche Einfluss verschiedener Kultivierungssysteme auf die Aufreinigung zu überpüfen und die Charakterisierung der Virusernten auf Systeme mit Mikroträgern auszudehnen. Abschließend sollte der Gehalt an Hämagglutinin-Antigen in den aufgereinigten Virussuspensionen mittels Antikörperpräzipitationstest („SRID assay“) entsprechend den Forderungen des EA bestimmt sowie die gemessenen DNA-Konzentrationen durch einen zweiten Nachweis überprüft werden, um die Richtigkeit der präsentierten Werte zu gewährleisten.
Schlagwörter :Biotechnologische Aufreinigung, Zentrifugation, Tangentialfluss-Ultrafiltration, Größenausschlusschromatographie, Anionenaustaus
Rechte :Dieses Dokument ist urheberrechtlich geschützt.
Größe :XVII, 200 S.
 
Erstellt am :19.10.2009 - 11:44:43
Letzte Änderung :22.04.2010 - 08:42:29
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